小分子代谢物定量检测与动态变化分析对于了解其生理功能、分析代谢通路、发现潜在疾病标志物等具有重要科学意义。活性硫物种（RSS）是生物体系内一类重要的小分子，包括生物硫醇、硫化氢、过硫化物以及二氧化硫（SO₂）等，在调控细胞氧化还原稳态、介导信号转导、参与能量代谢等方面都发挥着重要作用。SO₂作为生物体硫代谢途径中的关键代谢物参与多种生物过程，包括细胞增殖、凋亡、氧化应激、免疫反应、内质网应激等。越来越多的证据表明SO₂作为气体信号分子在生物体系内发挥重要作用。SO₂的含量异常可能与癌症、神经以及心血管疾病相关。因此，定量检测细胞内SO₂及其动态变化分析对于探究其生理功能具有重要意义。荧光探针因其灵敏度高被广泛应用于细胞内SO₂测定。然而，荧光探针容易受生物基质中背景荧光的影响，如细胞内的其他活性硫分子可能干扰定量结果，且通常需要消除外部背景干扰。因此发展无背景干扰的活细胞内源SO₂定量对于目前的分析测量方法仍然存在较高的要求和挑战。

高分辨核磁共振是一种无损的测量方法，并且可以提供丰富的待测物原子层次的变化信息，在生物大分子动态与互作研究中发挥着重要作用。近年来，高分辨核磁共振可以应用于活细胞测量。¹⁹F具有与¹H相似的核磁测量灵敏度，核磁位移变化范围广。由于生命体系中基本没有¹⁹F的信号，因此¹⁹F-核磁共振具有无背景信号干扰、测量灵敏度高、对周围化学环境敏感等优点，尤其适用于细胞研究。最近，南开大学苏循成团队发展了一种高效的细胞内源SO₂测定方法，通过¹⁹F-NMR可视化和量化不同活动物细胞内的SO₂以及培养基中的SO₂外排。所发展的高性能¹⁹F探针，P1-CF₃，能与活性硫（RSS）发生反应，产生不同的化学位移谱，这些信号可以在核磁谱上具有明显的区分，因此这类¹⁹F探针衍生的核磁信号可以当作RSS的指纹。基于该探针，研究团队实现了活细胞内SO₂的动态外排，量化了多种细胞系原位水平的SO₂含量差异，并且发现HEK293T细胞内SO₂主要是经由Cys的代谢通路产生。

图1. 先前报道的用于SO₂检测的反应官能团以及本工作中用于SO₂检测的探针结构与反应路线。图片来源：JACS

该团队在前期报道了可逆探针P1-F，其在实时定量活细胞内GSH表现出良好的性能（ACS Cent. Sci. 2023, 9, 1623-1632）。P1-F含有α-氰基丙烯酰胺，其可以在数秒内与生物硫醇发生反应。然而，单一氟在NMR检测中的低灵敏度限制了其对低含量RSS的检测能力。为了提高NMR检测的灵敏度，作者设计了一系列探针并测定了与二氧化硫的反应性能（图1）。结果表明探针P1-CF₃具有适中的疏水性且对SO₂具有高灵敏度，高反应活性（pH 6.5时反应速率达60000 (M•h)^-1），较大的化学位移色散。与探针P1-F相比，P1-CF₃与SO₂的反应产物峰的信噪比（SNR）提升14倍以上。

图2. 等浓度P1-F与P1-CF₃与Na₂SO₃反应产物信噪比与积分面积比较。图片来源：JACS

随后，作者在体外对探针P1-CF₃的性能进一步测试。测试结果表明探针对SO₂的响应具有浓度依赖，可实现浓度低至1 μM的准确测定，反应产物具有高稳定性，且该反应不受pH（6.5-8.5）以及温度（298K-310 K）的影响。此外，作者系统评估了探针与RSS的反应性以及对SO₂的选择性进行研究（图3）。结果表明，P1-CF₃能够与多种生物硫醇发生可逆反应，而与SO₂则生成更稳定的加合物，且该加合物的化学位移峰具有显著独特性，易于区分。通过EXSY实验进一步表明探针与SO₂的加合物解离较慢，反应接近不可逆。在混合物中的定量分析发现P1-CF₃对SO₂具有较高选择性。P1-CF₃对SO₂的快速响应率和高选择性，高灵敏度，以及P1-CF₃-SO₂加合物的高稳定性，证明了该探针即使在高丰度GSH和其他RSS条件下，用于活细胞内SO₂检测的巨大潜力。

图3. 探针P1-CF₃对SO₂的选择性。图片来源：JACS

基于上述优异的体外性能，作者进一步利用探针P1-CF₃进行了HEK293T细胞内SO₂的定量检测，并使用三氟乙酸盐作为内标（图4）。细胞内核磁实验显示，在-61.05 ppm与-61.26 ppm观测到与缓冲液中P1-CF₃-SO₂加合物一致的尖锐信号峰，因此作者认为观测到的信号峰为细胞外的P1-CF₃-SO₂产物信号峰（图4b-c）。此外，在-61.00 ppm和-61.21 ppm，还观察到两个接近P1-CF₃-SO₂尖锐信号的宽峰，这两个信号被归属为细胞内SO₂的产物信号峰。通过时间依赖性的细胞内¹⁹F NMR实验，作者发现细胞内SO₂含量维持在一定水平，而外排的SO₂含量明显增加（图4d）。以上实验和结果充分说明，通过¹⁹F NMR可实现活细胞内外SO₂的同时检测与定量（图4e）。

图4. 氟探针P1-CF₃定量活细胞内源SO₂。图片来源：JACS

HEK293T细胞中显著的内源SO₂水平促使作者探究不同细胞系之间是否存在差异。作者选择了不同类型的哺乳动物细胞系，包括HepG2、A549、HEK293F和NIH-3T3，涵盖癌细胞与正常细胞类型。实验结果表明细胞内SO₂因细胞系类型不同而存在显著差（图5a-b）。在HEK293细胞家族中测定到较高水平的SO₂（其中HEK293F相对低于HEK293T）。然而，其他细胞系在细胞内和细胞外培养基中显示较低水平的SO₂。值得注意的是，虽然与正常细胞相比，癌细胞中富集了更高水平的GSH，这可能有利于增加SO₂的生成，但结果出乎意料地显示，所选用的癌细胞中的SO₂含量实际上低于HEK293细胞。该现象与先前的研究存在一致性——SO₂前药可促进癌细胞中ROS产生并诱导细胞凋亡，从而用于癌症治疗，这表明癌细胞对于SO₂浓度变化更加敏感。为了进一步揭示不同细胞间SO₂含量差异的原因，作者以HEK293T与HepG2细胞为例，通过RT-qPCR检测了SO₂代谢通路中各种酶的mRNA表达水平，包括谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT1/2）、硫代硫酸盐磺基转移酶（TST）、线粒体硫双加氧酶（ETHE1）和亚硫酸盐氧化酶（SO）（图5c）。结果显示，HEK293T和HepG2细胞中TST mRNA表达水平无差异，而HEK293T细胞中GOT1/2 mRNA水平高于HepG2细胞（图5d）。此外，RT-qPCR结果显示，在两种细胞系中，GOT1的mRNA水平远高于GOT2的表达水平。因此，作者认为HEK293T细胞中SO₂的高水平可能是GOT1表达水平高的原因。

图5. 氟探针P1-CF₃比较不同细胞中SO₂水平。图片来源：JACS

基于以上观察结果，作者提出HEK293T细胞主要通过Cys/GOT1途径产生内源性SO₂（图6）。为了验证这一假设，作者测定了含0.5 mM Cys或GSH的培养基培养HEK293T细胞不同时间后细胞培养液中的SO₂水平。实验结果显示补充Cys的培养基中SO₂含量明显增加，而添加0.5 mM GSH的培养基中SO₂含量没有明显增加（图6a-b）。为了验证这一观察结果，作者进行了细胞内实验。与细胞培养基的结果相似，添加1.0 mM Cys的HEK293T细胞中SO₂含量较对照组增加（图6c-d）。为了进一步证实猜想，作者通过GOT1酶抑制剂处理细胞来检测细胞内SO₂的变化。实验结果表明GOT1抑制剂处理后SO₂含量显著降低（图6e-f）。因此，以上结果均表明HEK293T细胞中的SO₂可能主要由Cys在GOT1酶的作用下产生，并且产生的SO₂被持续排出细胞外。

图6. 额外补充半胱氨酸和谷胱甘肽对活哺乳动物细胞中SO₂生成的影响。图片来源：JACS

综上所述，作者发展了一种高性能氟探针P1-CF₃，其具有高选择性、高反应性、高稳定性和独特的化学位移分布，可用于SO₂含量的定量检测。该方法为实时、原位、高分辨率地定量活细胞中的SO₂提供了一个可靠的工具，为无创性、高效地监测活细胞中的SO₂水平和相关生理事件提供了一个有力的手段。这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society上，南开大学化学学院苏循成教授为通讯作者，南开大学的博士研究生崔朝玉和李斌为共同第一作者。该工作得到了中国科学院战略重点研究计划（XDC0170000）、国家自然科学基金（22161142018、22174074、21991081）和科技部（2021YFA1600304）资助。

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Visualization and Quantification of Base-Level SO₂ in Live Cells without Intracellular Background Interference Using Sensitive ¹⁹F-NMR

Chao-Yu Cui,^‡ Bin Li,^‡ Xing Zhang, Shu-Li Guo, Bin-Bin Pan, and Xun-Cheng Su*

J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 19893–19901. DOI: 10.1021/jacs.5c04351

导师介绍

苏循成

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